Prólogo


Dado que las “Nuevas estrategias en la monitorización terapéutica de fármacos inmunosupresores técnicas de microsampling de sangre seca y muestras de fluido oral” (Tesis Doctoral de la Dra. Lucía Paniagua González) son algo novedoso en nuestro país (y también a nivel mundial), el objetivo principal de la creación de esta web es la transferencia de conocimiento, abierta y accesible a todo tipo de público.

Por otro lado, el impacto social que podría conllevar la implementación de estudios similares y de estas técnicas a la clínica, mejorando la calidad de vida de muchos tipos de pacientes, es enorme. No obstante, los resultados de las investigaciones suelen quedar “relegados” al ámbito de la disciplina concreta en la que se desarrollan, lo que va en contra de los intereses de la sociedad a todos los niveles; debemos hacer llegar los nuevos hallazgos o resultados de los estudios tanto a sanitarios como a instituciones y a pacientes y población en general, para que no tarden décadas en poderse implementar en la “realidad”.

El contenido se divide en secciones, algunas dirigidas a un grupo específico como puede ser el personal sanitario, pacientes, otros grupos de investigación o investigadores/as, con un material, lenguaje y apoyo audiovisual acordes a ellos, y otros apartados dirigidos a un público general.

Todo el contenido de esta web está diseñado como material de divulgación científica, incluyendo plantillas descargables para facilitar además la transferencia de los conocimientos y su implementación en otros proyectos, hospitales, para realizar investigaciones similares, consultas de investigadores/as interesados/as en este campo, etc.

En resumen, hay diferentes potenciales “beneficiarios/as” de los contenidos puestos a disposición de todo el mundo en esta Web, como los siguientes ejemplos:

  • El propio personal sanitario y los propios participantes en el estudio llevado a cabo durante la Tesis Doctoral
  • Otros grupos de investigación o investigadores/as que deseen desarrollar un estudio de características similares u obtener más información sobre este tipo de estudios (las técnicas empleadas, los resultados obtenidos, el reclutamiento de paciente, la documentación necesaria, la organización del estudio, etc.)
  • Hospitales interesados en llevar a cabo estudios similares o incluso en implementar estas técnicas en sus análisis
  • Instituciones sanitarias y gobiernos, para que estén a la vanguardia científica y puedan financiar este tipo de estudios e incluirlos y aprobarlos en la práctica clínica
  • Estudiantes que se interesen por este tipo de información o profesores/as que deseen ampliar sus conocimientos en el campo para poder, a su vez, divulgarlos

I. Entendiendo las técnicas de Microsampling de sangre seca


Las técnicas de microsampling se basan en la obtención de micromuestras biológicas (normalmente de <50 μL) de una forma mínimamente invasiva para el paciente. Aunque existen variaciones de estas técnicas, las más conocidas y empleadas son las basadas en la obtención de sangre capilar mediante punción digital. Debido a su facilidad de toma de muestra y a su baja invasividad, estas técnicas fueron concebidas como alternativas a los métodos de toma de muestras convencionales, principalmente la venopunción.

Dependiendo de la técnica y/o dispositivo de microsampling empleado, se pueden obtener especímenes cuya matriz se mantiene en su estado original (muestras “líquidas”) o especímenes en forma de matriz seca sobre un soporte. Esta última opción, las micromuestras secas, es la más estudiada e interesante, puesto que los especímenes secos poseen un menor riesgo biológico, mayor estabilidad para muchos compuestos, y su envío y almacenamiento son más sencillos y baratos.

En la presente Tesis nos centraremos en la descripción y estudio de técnicas y dispositivos de microsampling destinados a la obtención de muestras de sangre seca, ya que esta es la matriz empleada para la TDM de fármacos inmunosupresores (y, en general, para la monitorización terapéutica de cualquier fármaco). La obtención y uso de micromuestras capilares posee numerosas ventajas con respecto al muestreo venoso tradicional:

  • Toma de muestra sencilla: la toma de muestras es más fácil que la venopunción, eliminando la necesidad de personal sanitario especializado para su recolección. Esto, a su vez, permite el automuestreo en el hogar por el propio paciente (o un allegado), o el muestreo en ubicaciones remotas y envío directo al laboratorio.
  • Baja invasividad: son técnicas mucho menos invasivas que la punción venosa, lo cual es una ventaja importante considerando la frecuencia de análisis de sangre en ciertas aplicaciones (TDM, curvas farmacocinéticas, etc.), así como para pacientes pediátricos u otras poblaciones especiales (pacientes psiquiátricos, pacientes críticos), y en estudios con animales.
  • Fácil automatización y procesos menos costosos: en general, se trabaja con volúmenes de disolventes muy pequeños y las extracciones son muy sencillas, lo que abarata los análisis. Además, los procesos de extracción se pueden automatizar fácilmente, optimizando los tiempos de análisis y su coste.
  • Envío y almacenamiento sencillos y menos costosos: aunque aplica al conjunto de las micromuestras en general, esto es especialmente relevante cuando se usan micromuestras secas, ya que no suelen necesitar conservación en frío y los compuestos en ellas son muy estables bajo diferentes condiciones climatológicas a lo largo del tiempo.
  • Bajo riesgo biológico: de nuevo, esto es especialmente relevante en el caso de muestras secas.

Pese a todas estas ventajas, el uso de estas técnicas exige en la mayoría de los casos contar con equipos instrumentales altamente sensibles que permitan la detección de los compuestos a bajas concentraciones y empleando poco volumen de muestra, así como de un desarrollo y validación de los métodos más minucioso que en el caso de las muestras tradicionales.

DBS

Las gotas de sangre seca o DBS (Dried Blood Spots) fueron la primera técnica de microsampling desarrollada. Durante décadas monopolizaron este campo, hasta que recientemente surgieron técnicas y dispositivos alternativos, creados para resolver algunas de las limitaciones del empleo de DBS que se verán más adelante. Estas complicaciones o inconvenientes de su uso propiciaron la aparición de técnicas y dispositivos de microsampling más novedosos, creados para resolver estos problemas, , con especial énfasis en los dispositivos basados en la técnica VAMS (Volumetric Absorptive Microsampling), puesto que, junto con las DBS, son las técnicas estudiadas en esta Tesis para la determinación de fármacos inmunosupresores.

En la evaluación de las DBS se ha demostrado que, a diferencia de lo que ocurre con las matrices tradicionales, los aspectos preanalíticos son críticos, y el obviar dicha validación constituye la mayor fuente de error en los análisis y provoca resultados de baja fiabilidad. Sin embargo, la falta de guías específicas para este tipo de muestras provocó que, durante décadas, estos factores clave fueran pasados por alto o evaluados incorrectamente, reportándose que casi la mitad de los métodos de DBS existentes en la literatura no incluyen la validación de ningún parámetro específico de DBS. En la Figura que se puede ver más abajo se describen los factores preanalíticos críticos que se deben considerar y evaluar cuando se pretenden desarrollar e implementar métodos para la TDM en DBS convencionales. Cada factor está íntimamente relacionado con una o varias etapas de la recogida, procesado y análisis de las muestras, y puede evaluarse durante la fase de desarrollo, prevalidación o validación de la metodología analítica, según corresponda.

Factores preanalíticos críticos a considerar en los métodos de DBS convencionales:

Los métodos basados en DBS deben seguir una validación analítica y una validación clínica. En la validación analítica, además de los parámetros clásicos incluidos en las guías tradicionales, se incluyen varios parámetros específicos de las DBS, cuya evaluación es crítica para el desarrollo de métodos fiables: el efecto del volumen, la homogeneidad y el hematocrito (Hcto). Estos 3 efectos están altamente relacionados entre ellos, por lo que se deben estudiar conjuntamente cuando se desarrolla un nuevo método basado en DBS, diseñando pruebas de laboratorio que cubran todo el rango de posibles situaciones que se puedan producir en un contexto real.

Parámetros a evaluar durante la validación de métodos basados en DBS:

DIFERENTES DISPOSITIVOS DE MICROSAMPLING DE SANGRE SECA

Representación gráfica de los distintos métodos de microsampling de sangre seca existentes (comercializados y pendientes de comercialización):

VAMS

Aunque las DBS son la técnica de microsampling más conocida, estudiada y establecida, el microsampling por absorción volumétrica o VAMS ha ido ganando relevancia en los últimos años. En la actualidad, solo existen bajo el nombre de una casa comercial, por lo que también se suelen conocer con la denominación de esa marca, MitraTM VAMS, que salió al mercado en el año 2014. Como su nombre indica, las VAMS recogen la muestra biológica (en este caso sangre) por absorción volumétrica mediante un polímero hidrofílico, donde queda retenida y sobre el que se seca. Este polímero será separado del enganche del dispositivo en el laboratorio y sometido al proceso de extracción, que puede ser automatizado.

Las VAMS permiten la recogida de un volumen fijo de sangre total, independientemente del Hcto de la muestra, según las indicaciones del fabricante, y que ha sido demostrado en varios estudios independientes. De esta forma, resuelven los inconvenientes asociados al análisis de DBS (especialmente cuando no se analiza la gota completa): falta de homogeneidad de la gota de sangre y volumen de sangre desconocido, ya sea en la muestra recogida inicialmente o el obtenido al recortar la gota. Sin embargo, tal y como se vió en las consideraciones preanalíticas a tener en cuenta en el análisis de las DBS, que una técnica de microsampling de sangre seca haya resuelto su sesgo volumétrico derivado del impacto del Hcto no evita que existan otros sesgos, como el de recuperación o el de efecto matriz. En el caso de las VAMS, se ha demostrado que el Hcto es un factor determinante en la recuperación de los analitos del polímero y, por lo tanto, tendrá un impacto en la cuantificación de la metodología. Por ello, es necesario tener mucha precaución también cuando se desarrollan métodos en VAMS, y realizar una validación analítica y clínica en concordancia. Para ello, puede emplearse como referencia la guía para métodos basados en DBS publicada por la IATDMCT.

***Nota aclaratoria: toda la información e imágenes contenidos en este apartado es de elaboración propia y se ha extraído de la Tesis Doctoral de la Dra. Lucía Paniagua González.

II. Información para personal sanitario


II.I. Información básica sobre el proyecto. Muestras y documentos necesarios

Objetivos del estudio

Estudiar los niveles de fármacos inmunosupresores en sangre venosa, sangre capilar (recogida con dos dispositivos diferentes) y saliva de pacientes trasplantados, con el fin de establecer correlaciones entre ellos y así poder valorar el de la sangre capilar y de la saliva como alternativas a la sangre venosa obtenida por venopunción tradicional en la monitorización terapéutica de los mismos.

Población de estudio

Pacientes trasplantados que sigan tratamiento inmunosupresor, y que voluntariamente quieran participar en el estudio, una vez informados de las características del mismo, y previa firma del Documento de Consentimiento informado (aprobado por el Comité Ético de la Investigación Clínica de Galicia). Todos los participantes deberán ser mayores de edad.

Número de casos necesario

El número de casos se estima en 150, pudiendo este variar en función del número de los pacientes disponibles y que acepten participar en el estudio, los nuevos trasplantes realizados en el tiempo de reclutamiento de las muestras, y otros factores como la obtención de muestras reales suficientes para monitorizar todos los fármacos incluidos en el estudio.

En todo caso, se necesitarán COMO MÍNIMO 40 muestras emparejadas para cada fármaco para llevar a cabo la validación clínica, siendo 80 el número óptimo para realizar una validación clínica totalmente completa según las indicaciones de la IATDMCT (Official International Association for Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology Guideline: Development and Validation of Dried Blood Spot-Based Methods for Therapeutic Drug Monitoring; doi: 10.1097/FTD.0000000000000643).

Periodo de reclutamiento

El periodo de reclutamiento teórico establecido es de 12 meses, pudiendo variar en función de las directrices del Hospital y de los investigadores colaboradores.

Recogida de las muestras

En los distintos hospitales participantes, y aprovechando la toma de muestra de sangre para la monitorización terapéutica que se realiza a los pacientes trasplantados (tanto ingresados como los que permanecen en seguimiento y tratamiento al regresar a sus hogares) y/o las tomas de muestra para análisis general de sangre, se tomarán las siguientes muestras:

  • Sangre venosa, anticoagulada (1 tubo tapón lila/violeta EDTA)
  • Saliva: Al mismo tiempo que se toma la muestra de sangre, se facilitará al paciente un tubo de recogida de muestra de saliva, con las instrucciones adecuadas para su toma
  • Sangre capilar, obtenida sobre soporte sólido empregando tarxetas Whatman 903 para as DBS (Dried Blood Spots) y en soporte Mitra VAMS: en el momento de toma de muestra de sangre venosa, se practicará también una punción con lanceta en la yema de un dedo de la mano al paciente, depositando 2 gotas de sangre sobre unas tarjetas específicamente diseñadas para llevar a cabo el análisis y acto seguido generando una gota grande de sangre en la superficie del dedo para ponerla en contacto con el dispositivo VAMS (los materiales serán facilitados previamente al Hospital).

Cuestionario de datos clínicos (“Ficha de recogida de datos”)

Junto con las muestras de cada paciente se enviará al Laboratorio de Toxicología un “dosier” con información clínica relevante para el estudio de cada caso. Para ello se cubrirá una ficha que contendrá información sobre edad, sexo, peso y DOSIS DE CADA FÁRMACO INMUNOSUPRESOR ADMINISTRADA AL PACIENTE, así como los aspectos más relevantes de su estado clínico (infecciones, pérdida peso,etc.). También se remitirá una copia de los resultados de la analítica general realizada al paciente ese mismo día de obtención de las muestras.

Identificación del caso

Cada caso irá identificado con un código alfanumérico, que será colocado tanto en cada una de las muestras, como en la ficha clínica y en la copia de la analítica. Para ello se facilitarán etiquetas adhesivas con el listado de códigos correspondiente. El personal sanitario autorizado será el encargado de llevar un listado en el que relacione el número de historial clínico de cada paciente con el código anonimizado enviado al laboratorio.

Envío de las muestras al laboratorio de Toxicología del Instituto de Ciencias Forenses de la Universidad de Santiago de Compostela.

Las muestras de sangre seca se dejarán secar durante al menos 2h a temperatura ambiente, tras las que se guardarán en bolsas de cierre hermético (zip), dentro de las cuales habrá dos sacos de gel de sílica para retirar la humedad residual.

Todas las muestras específicas para toxicología se mantendrán refrigeradas hasta su recogida (en el mismo día o al día siguiente) por el servicio de mensajería, y se trasladarán a temperatura ambiente debido a la gran estabilidad de las muestras de sangre seca y al rápido envío de todas las muestras.

El dosier con la documentación clínica será enviado en un sobre identificado con la pegatina del código alfanumérico correspondiente.

En Resumen

En cada sobre ETIQUETADO CON EL CÓDIGO DEL PACIENTE se incluirán:

  1. 1 TUBO DE SANGRE EDTA (codificado)
  2. 1 TUBO DE SALIVA SILANIZADO, bien tapado y precintado (codificado)
  3. 1 MITRA EN CAJA CON SÍLICA GEL (codificado)
  4. 2 DBS en tarjeta Whatman, DENTRO DE BOLSA HERMÉTICA CON SÍLICA GEL (codificado)
  5. FICHA DE RECOGIDA DE DATOS CUBIERTA (codificada)
  6. RESULTADOS ANALÍTICA DE SANGRE
    • HEMATOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
    • MONITORIZACIÓN FARMACOTERAPÉUTICA-Inmunosupresores

NOTAS IMPORTANTES (comprobaciones y anotaciones previas al envío de las muestras para asegurar su trazabilidad, anonimidad y calidad de las muestras)

  • Comprobar que todo se guarda correctamente etiquetado con el código del paciente PREVIAMENTE al envío
  • Cubrir el “Listado de relación pacientes/códigos anonimizados” y el “Listado de comprobación de TODAS LAS MUESTRAS Y DOCUMENTOS NECESARIOS”

II.II. Instrucciones para la correcta toma de muestras

Protocolo de toma de muestras y conservación de sangre venosa

Protocolo de toma de muestras y conservación de fluido oral

Protocolo de toma de muestras y conservación de sangre capilar en VAMS

Protocolo de toma de muestras y conservación de sangre capilar en DBS

II.III. Instrucciones para la correcta conservación y envío de las muestras al laboratorio

  • Las muestras de sangre seca se dejarán secar durante al menos 2h a temperatura ambiente, tras las que se guardarán en bolsas de cierre hermético (zip), dentro de las cuales habrá dos sacos de gel de sílica para retirar la humedad residual.
  • Todas las muestras específicas para toxicología se mantendrán refrigeradas hasta su recogida (en el mismo día o al día siguiente) por el servicio de mensajería, y se trasladarán a temperatura ambiente debido a la gran estabilidad de las muestras de sangre seca y al rápido envío de todas las muestras.
  • El dosier con la documentación clínica será enviado en un sobre identificado con la pegatina del código alfanumérico correspondiente.

Ver apartado II.I. "En cada sobre ETIQUETADO CON EL CÓDIGO del paciente..." para más información.

II.IV. Plantillas descargables

Fichas de Recogida de Datos
Descargar Ficha de Recogida de Datos (docx)
Listado Anonimización y Trazabilidad de Pacientes
Descargar Listado Anonimización y Trazabilidad de Pacientes (docx)
Instrucciones sangre venosa y saliva
Descargar Instrucciones sangre venosa y saliva (pdf)
Instrucciones obtención muestras sangre capilar seca: DBS y VAMS
Descargar Instrucciones obtención muestras sangre capilar seca: DBS y VAMS (pdf)

III. Información para pacientes


III.I. Sobre el estudio

Participación en el Estudio

La participación en este estudio es completamente voluntaria y los resultados serán anónimos. Este estudio cuenta con la aprobación del Comité Ético de Investigaciones Clínicas de Galicia, y se le entregará un consentimiento informado con toda la información relevante del estudio para que la pueda consultar antes de aceptar participar y llevársela consigo.

Objetivos del estudio:

  • Desarrollar una metodología analítica que permita analizar los fármacos inmunosupresores más empleados en España (tacrolimus, sirolius, everolimus, ciclosporina A y ácido micofenólico) en muestras biológicas distintas de la sangre venosa, en concreto, gotas de sangre seca extraídas por punción de la yema del dedo, o en saliva.
  • Predecir los niveles en sangre a partir de las concentraciones en las micromuestras secas y en saliva.

Relevancia de su participación en el estudio y del mismo:

Este estudio puede ser muy importante para usted y para otros/as pacientes en el futuro, ya que, de poder establecerse esas correlaciones, se mejoraría su calidad de vida ya que no tendría que someterse a la extracción de una muestra de sangre venosa para controlar la eficacia de su tratamiento inmunosupresor.

Se necesita la participación de pacientes como usted, a tratamiento con los fármacos incluídos en el estudio, para establecer las correlaciones anteriormente mencionadas y estudiar la aplicación de los métodos alternativos al tradicional en casos reales.

Implicaciones de su participación en el estudio:

Su participación en este estudio implicará la obtención y análisis de muestras de sangre venosa, sangre capilar seca (mediante la punción en la yema de un dedo) y de saliva. Las muestras biológicas que se le extraerán serán analizadas para medir los niveles de fármacos inmunosupresores en ellas.

Su participación no requerirá de visitas adicionales al hospital, ya que las muestras se obtendrán cuando acuda a su revisión rutinaria. Puede ser necesario obtener muestras en varios días que usted acuda a revisión.

Duración total estimada de su participación el día de la obtención de muestras: 15 minutos

Molestias o inconvenientes de la participación en el estudio (toma de muestras):

  • Las molestias o riesgos menores asociados a la extracción de las muestras biológicas adicionales son mínimos:
  • La muestra de sangre venosa se obtendrá en el mismo momento (y aprovechando el mismo pinchazo) en el que se le extrae sangre para realizar la analítica rutinaria de control.
  • Las muestras de sangre seca se obtendrán por punción con lanceta en la yema del dedo, lo que puede producir una pequeña molestia.
  • La toma de muestra de saliva no causará ninguna molestia, puesto que simplemente deberá acumular fluido oral en su boca durante 5 minutos y verterlo en un tubo de recogida.

En caso de cualquier duda, en la copia del consentimiento informado firmado que le entregará el personal sanitario aparece tanto el contacto de dicha persona como el del laboratorio de Toxicología (también puede consultar la pestaña de “VI.Contacto” en esta misma página web).

III.II. Sobre la toma de muestras en el Hospital y el automuestreo domiciliario

Procedimiento de Toma de Muestras

Para asegurar las mínimas molestias para los pacientes, la toma de muestras se llevará a cabo en su cita normal para la extracción rutinaria de sangre venosa para el control de sus niveles de inmunosupresores.

A) Toma de muestras en el Hospital

El día de su cita médica, aprovechando la venopunción a la que se somete con regularidad, se le tomarán las siguientes muestras, por los métodos de recolección que se señalan a continuación:

B) Estudio de automuestreo domiciliario

Si decide participar en este proyecto piloto, se le explicará de forma oral y por escrito (con la información que se detalla a continuación y que se puede descargar en el punto III.III) cómo debe llevarse a cabo tanto la toma de muestras como su envío al laboratorio. En su cita médica correspondiente, el personal sanitario del Hospital le hará entrega de un sobre con una etiqueta con la dirección del Laboratorio de Toxicología de la Universidad de Santiago de Compostela, así como un sello postal para que no tenga que ir a una oficina de correos para enviarlo ni pagar por ello.

El sobre además contendrá en su interior:

  • Una copia de las instrucciones con fotografías como apoyo
  • Una lanceta desechable
  • Una caja de plástico etiquetada con un código y con un dispositivo similar a un hisopo
  • Una tarjeta de papel/cartón con unos círculos impresos y con el mismo código
  • Una bolsa de zip con papel desecante

Se llevará el sobre a su casa y, el día que tenga concertada su siguiente cita para la extracción rutinaria de sangre venosa, llevará a cabo antes de salir de casa todo el procedimiento de automuestreo que se indica más abajo y en las instrucciones que se le habrán entregado.

Dejará secar durante mínimo 2h las muestras y, tras ello, las introducirá en el sobre, lo cerrará, y lo enviará por correos, ya sea en una oficina o metiéndolo en el buzón de Correos más cercano a donde se encuentro o a su domicilio.

Instrucción de toma de muestras

III.III. Plantilla descargable

IV. Sobre esta investigación


Investigación sobre la Monitorización Terapéutica de Fármacos Inmunosupresores empleando técnicas de Microsampling de sangre seca

Esta investigación está encuadrada dentro de la Tesis Doctoral “Nuevas estrategias en la monitorización terapéutica de fármacos inmunosupresores: técnicas de microsampling de sangre seca y muestras de fluido oral” de la Dra. Lucía Paniagua González. Presenta un alto grado de innovación en el área de las Ciencias de la Salud. Más concretamente, en los campos de la Toxicología Clínica, la Monitorización Terapéutica de Fármacos (TDM por sus siglas en inglés) y las técnicas de Microsampling de sangre seca.

Esta investigación se centra en el desarrollo de nuevas metodologías para el seguimiento farmacológico de los fármacos inmunosupresores, y su aplicación a muestras de pacientes trasplantados/as hepáticos. Los fármacos inmunosupresores son un grupo de fármacos que se emplean para prevenir el rechazo del órgano trasplantado y son vitales para la subsistencia del propio órgano y del/a paciente trasplantado/a.

No obstante, su estrecho margen terapéutico (las concentraciones sub-terapéuticas, terapéuticas y toxicológicas son muy próximas) y su variabilidad farmacocinética inter- e intraindividual, hace primordial monitorizar sus niveles para asegurar un adecuado tratamiento a lo largo de toda la vida de los/as pacientes, al tratarse de un tratamiento crónico.

Aspectos Clave


Población de Galicia
La población de Galicia (sobre todo la de mayor media de edad, coincidiendo con una gran parte de los/as receptores de donaciones de órganos) se encuentra muy diseminada.

Hay pocos hospitales especializados en cada tipo de trasplante.
Hospitales Especializados

Monitorizaciones Inmunosupresores
Las monitorizaciones de los inmunosupresores se hacen con frecuencia y durante toda la vida -al tratarse de tratamiento crónicos y con variabilidad intraindividual-, implicando el traslado de los/as pacientes a su centro de salud más próximo o, en muchos casos, al propio Hospital en el que fueron trasplantados/as.

Las monitorizaciones “rutinarias” en los centros de salud/hospitales se llevan a cabo mediante el análisis de sangre venosa/plasma obtenidos por punción venosa, una técnica altamente invasiva, y muy molesta/dificultosa en poblaciones tanto pediátricas, como envejecidas, con problemas mentales, etc.
Monitorizaciones Rutinarias

Curvas Farmacocinéticas
Cuando los/as pacientes ingresan para la cirugía, se llevan a cabo curvas farmacocinéticas de los inmunosupresores que se les pautarán, para estudiar su caso particular. De este modo, se toman muestras de sangre por punción venosa cada 2h durante uno o varios días, con las consecuencias que eso conlleva, como la formación de grandes hematomas en la zona y gran incomodidad tanto para los/as pacientes como para el personal sanitario que las lleva a cabo.

La punción venosa, en poblaciones envejecidas, constituye a veces un reto y provoca grandes hematomas, mientras que, en poblaciones pediátricas, es también difícil de obtener sangre venosa en volumen suficiente. La invasividad de la técnica es algo común a todo tipo de poblaciones, pero especialmente las más vulnerables (mayores, niños/as y gente con problemas mentales).
Punción Venosa

De este modo, en esta investigación se estudian varias alternativas a la punción venosa: las técnicas de microsampling de sangre seco, más concretamente las DBS (gotas de sangre seco o Dried Blood Spots) no volumétricas y las Mitra VAMS (Volumetric Absorptive Microsampling), ambas para obtener sangre capilar, y el fluido oral como muestra.

Todas estas alternativas son mucho más ventajosas con respecto al método tradicional (punción venosa):

Población de Galicia
No son invasivas en el caso del fluido oral, y muy poco invasivas en el caso de las técnicas de Microsampling, en las que se realiza una punción digital de la que se extraen gotas de sangre, necesitando un volumen inferior a 50 µL

La recogida de muestra es muy sencilla, permitiendo el automuestreo por parte del/a propio/a paciente (o algún familiar) en su domicilio y enviarlas por correo postal al laboratorio de referencia, evitando traslados innecesarios
Población de Galicia

Población de Galicia
Tienen menos riesgo biológico y una mayor estabilidad

Su transporte, almacenamiento y extracción son más sencillos y menos costosos
Población de Galicia

No obstante, pese a todas las ventajas que supondría la potencial aplicación de estas técnicas, al inicio de esta investigación, este campo estaba casi sin explorar (basándonos en las búsquedas bibliográficas en diferentes bases de datos científicas internacionales, como Pubmed, y empleando diversas combinaciones de términos clave), no existiendo estudios (publicados) similares o, de existir, aportando información muy escasa o de “validez y fiabilidad limitadas” (presentando metodologías sin validar, con validaciones incompletas, sin estudios de estabilidad, sin seguir las recomendaciones de los organismos oficiales, sin aplicación a muestras reales, etc.).

Con este proyecto, la Dra. Paniagua abrió una nueva línea de investigación en el grupo de investigación al que pertenece, FORTOX, una línea totalmente nueva y diferente a las líneas en las que se ha especializado el grupo durante décadas. A pesar de esto, en unos pocos años, su trabajo, innovación y aportación en ese campo, además de las publicaciones y comunicaciones científicas pertinentes y de la colaboración con el pionero mundial en el empleo de estas técnicas, hizo que FORTOX se haya posicionado como un grupo referente en el uso de este tipo de muestras. Así, a día de hoy, esta línea de investigación sigue activa, y se está empleando el conocimiento de la Dra. Paniagua para el desarrollo del Proyecto de Generación de Conocimiento adjudicado al grupo FORTOX en el 2022, aplicando las técnicas de Microsampling de sangre seca para la monitorización de fármacos antiepilépticos en poblaciones pediátricas, en colaboración con las unidades de pediatría y neurología pediátrica de los Complejos Hospitalarios Universitarios de Santiago de Compostela (CHUS), Vigo (CHUVI) y Ferrol (CHUF).

Como conclusión, los resultados obtenidos son muy positivos y relevantes para la práctica clínica, generándose un gran potencial para su implementación en la práctica clínica y la mejora de la calidad de vida de muchos y muchas pacientes, no solo trasplantados/as, sino también de otro tipo de poblaciones en las que se pueden implementar estas técnicas (como pacientes a tratamiento con fármacos antipsicóticos, antiepilépticos, etc.). De hecho, el grupo de investigación FORTOX al que pertenece la Dra. Paniagua es el único grupo en España que trabaja con técnicas de microsampling en el área de la Toxicología Clínica y de la TDM, y uno de los pocos grupos en todo el mundo.

V. Resultados del proyecto y su difusión (publicaciones, congresos, tesis)


V.I. Publicaciones/artículos científicos

Método en VAMS

"Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS) for assaying immunosuppressants from venous whole blood by LC- MS/MS using a novel atmospheric pressure ionization probe (UniSpray™)"

  • Primer uso de la fuente de ionización UniSprayTM para aumentar la sensibilidad de los inmunosupresores. De hecho, fue la tercera publicación a nivel mundial que utilizó dicha fuente de ionización para cualquier aplicación analítica.
  • En las muestras de micromuestreo, los procedimientos desarrollados fueron simples, rápidos y altamente sensibles, alcanzando los LLOQ (límites bajos de cuantificación) más bajos reportados en la literatura para todos los inmunosupresores.
  • Ambas metodologías de micromuestreo estudiadas fueron completamente validadas, informando del estudio de estabilidad más largo para inmunosupresores en micro muestras de sangre seca existente hasta el momento.
  • Además, las validaciones cumplen con las recomendaciones de la (en aquel momento recién "salida del horno") "Directriz Oficial de la Asociación Internacional para el Monitoreo Terapéutico de Fármacos y Toxicología Clínica: Desarrollo y Validación de Métodos Basados en Muestras de Sangre Seca para el Monitoreo Terapéutico de Fármacos" (Official International Association for Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology Guideline: Development and Validation of Dried Blood Spot-Based Methods for Therapeutic Drug Monitoring).
  • Primer aplicación de las Mitra VAMS a muestras reales para la determinación de inmunosupresores.
  • Primera validación clínica para el ácido micofenólico en Mitra VAMS.

El monitoreo terapéutico de fármacos (TDM) inmunosupresores (IMS) es crucial para prevenir el rechazo o la toxicidad después de un trasplante de órgano sólido. Las técnicas de micromuestreo (muestreo <50 μL de sangre) pueden ser una buena alternativa al muestreo venoso convencional para el TDM, debido a sus numerosas ventajas, que incluyen un muestreo fácil y de bajo impacto, que permite la auto recolección, así como un envío y almacenamiento económicos. Además, el muestreo microabsorbente volumétrico (VAMS) permite la recolección de volúmenes precisos y exactos de sangre, superando el efecto del hematocrito (Hct) relacionado con las muestras de sangre seca, al tiempo que ofrece los mismos beneficios. En este trabajo, se desarrolló y validó un método de LC-MS/MS para la determinación de los 5 IMS más comunes (ácido micofenólico -MPA-, tacrolimus -TAC-, sirolimus -SIR-, everolimus -EVE- y ciclosporina A -CsA-) en sangre venosa recolectada con dispositivos VAMS Mitra™, utilizando una novedosa interfaz LC-MS/MS, Unispray™. El método fue completamente validado, incluyendo linealidad, límites de detección (LOD) y cuantificación (LLOQ), precisión, exactitud, selectividad, arrastre, efecto de matriz, recuperación, impacto del Hct en la recuperación y estabilidad a corto/largo plazo, cumpliendo con los criterios de aceptación en todos los casos. Las LLOQs fueron de 0.5 ng/mL para TAC, SIR y EVE, 20 ng/mL para CsA y 75 ng/mL para MPA. No se encontró ningún impacto del Hct (rango: 0.2 a 0.62 L/L) en la recuperación de ningún analito. Todos los compuestos fueron estables en VAMS durante al menos 8 meses a -20 °C. Además, como parte de la validación del método analítico de VAMS, realizamos por primera vez un amplio estudio estadístico para comparar las concentraciones de sangre venosa líquida de pacientes bajo tratamiento con TAC (n=53) y MPA (n=20) con aquellas observadas cuando las mismas muestras se absorbieron en VAMS. Nuestros resultados mostraron que las concentraciones de VAMS de sangre venosa estaban correlacionadas con las encontradas en la sangre venosa líquida original, demostrando que el material VAMS en sí no sesgará las concentraciones de medicamentos en sangre. Por lo tanto, el presente método podría aplicarse para evaluar posibles correlaciones entre la sangre venosa y la sangre capilar recolectada con VAMS.

Abstract

Therapeutic drug monitoring (TDM) of immunosuppressants (IMS) is crucial to prevent rejection or toxicity after solid organ transplantation. Microsampling techniques (sampling <50 μL of blood) can be a good alternative to conventional venous sampling for TDM, due to their numerous advantages, including its easy and low-invasive sampling, enabling self-collection, and cost-saving shipment and storage. Furthermore, volumetric absorptive microsampling (VAMS) enables the collection of precise and accurate blood volumes, overcoming the hematocrit (Hct) effect related to dried blood spots, while offering the same benefits. In this work, an LC-MS/MS method for the determination of the 5 most common IMS (mycophenolic acid -MPA-, tacrolimus -TAC-, sirolimus -SIR-, everolimus -EVE- and cyclosporin A -CsA-) in venous blood collected with Mitra™ VAMS devices was developed and validated, employing a novel LC-MS/MS interface, Unispray™. The method was fully validated including linearity, limits of detection (LOD) and quantification (LLOQ), accuracy, precision, selectivity, carry-over, matrix effect, recovery, impact of Hct on recovery and autosampler and short-/long-term stability, satisfying acceptance criteria in all cases. LLOQs were 0.5 ng/mL for TAC, SIR and EVE, 20 ng/mL for CsA and 75 ng/mL for MPA. No impact of the Hct (range: 0.2 to 0.62 L/L) on recovery was found for any analyte. All compounds were stable in VAMS for at least 8 months at -20 °C. In addition, as part of the VAMS analytical method validation, we performed for the first time a broad statistical study to compare liquid venous blood concentrations from patients under TAC (n=53) and MPA (n=20) treatment to those observed when the same specimens were absorbed into VAMS. Our results showed that venous blood VAMS concentrations were correlated to those found in the original liquid venous blood, proving that the VAMS material itself will not bias blood drug concentrations. Therefore, the present method could be applied to evaluate possible correlations between venous blood and capillary blood collected with VAMS.

Link al artículo: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S073170852031308X?via%3Dihub

Comparación DBS Vs. VAMS

"Comparison of conventional dried blood spots and volumetric absorptive microsampling for tacrolimus and mycophenolic acid determination"

  • En las muestras de micromuestreo, los procedimientos desarrollados fueron simples, rápidos y altamente sensibles, alcanzando los LLOQ (límites bajos de cuantificación) más bajos informados en la literatura para todos los inmunosupresores.
  • Ambas metodologías de micromuestreo estudiadas fueron completamente validadas, informando del estudio de estabilidad más largo para inmunosupresores en micro muestras de sangre seca existente hasta el momento.
  • Además, ambas validaciones y publicaciones cumplen con las recomendaciones de la (en aquel momento recién "salida del horno") "Directriz Oficial de la Asociación Internacional para el Monitoreo Terapéutico de Fármacos y Toxicología Clínica: Desarrollo y Validación de Métodos Basados en Muestras de Sangre Seca para el Monitoreo Terapéutico de Fármacos".
  • Primera validación clínica para el ácido micofenólico en Mitra VAMS.
  • Único artículo empleando los criterios de aceptación de la EMA (Agencia Europea de Medicamentos) y de la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos) para la validación analítica (±20% de desviación para ≥67% de los pares de muestras), y los altamente estrictos criterios de la RCPA (Real Colegio de Patólogos de Australasia; para tacrolimus: ≤0,5 ng/mL para concentraciones <5 ng/mL, y ±10% para concentraciones ≥5 ng/mL; para el ácido micofenólico: ≤100 ng/mL para concentración <1000 ng/mL, y ±10% para concentraciones ≥1000 ng/mL).

El monitoreo terapéutico de fármacos (TDM, por sus siglas en inglés) inmunosupresores es esencial para evitar tanto el rechazo como la toxicidad después de trasplantes de órganos sólidos. Los enfoques de micromuestreo capilar son una alternativa destacada al muestreo venoso convencional para el TDM (recopilación fácil y no invasiva, posibilitando el auto-muestreo, y ahorro de costos en el envío, procesamiento y almacenamiento). El muestreo microabsorbente volumétrico (VAMS) ha ganado importancia en los últimos años, ya que se diseñó para superar los problemas relacionados con el hematocrito (Hct) comúnmente asociados al análisis de muestras de sangre seca (DBS, por sus siglas en inglés). A pesar de todos los beneficios, el rendimiento de las técnicas de micromuestreo (incluida una validación clínica exhaustiva) debe establecerse antes de su implementación en la práctica clínica. El objetivo de este estudio fue llevar a cabo una validación clínica tanto para el tacrolimus (TAC) como para el ácido micofenólico (MPA) en ambas muestras de sangre seca (DBS) y VAMS Mitra™. Para las validaciones clínicas, se establecieron dos requisitos diferentes: analíticos (siguiendo las directrices de la EMA y la FDA) y clínicos (siguiendo las recomendaciones del Royal College of Pathologists of Australasia -RCPA-). Para DBS, se cumplieron tanto los criterios de aceptación analíticos como clínicos para TAC, con el 98,7% y el 95% de las muestras pareadas dentro de los límites preestablecidos, respectivamente. Para MPA, se cumplió el criterio analítico (70,6% de las muestras pareadas), aunque solo la mitad de las parejas estaban dentro de los límites clínicos. Para VAMS, la validación clínica tanto para TAC como para MPA mostró buenas correlaciones pero concentraciones significativamente más bajas en VAMS en comparación con las matrices rutinarias. Después de la corrección de las concentraciones en VAMS, se cumplieron los requisitos analíticos para ambos analitos (71,1% para TAC, 75% para MPA), aunque no se cumplieron los criterios más restrictivos recomendados por la RCPA para ningún analito (la mitad de las muestras quedaron dentro del área de aceptación). Además, no se encontró un impacto significativo del hematocrito en la cuantificación en ningún caso. También se estableció un ensayo preliminar de muestreo en el hogar, mostrando resultados prometedores. Además, se llevó a cabo una comparación entre el rendimiento analítico y clínico de VAMS frente a DBS, incluyendo un ensayo de muestreo en el hogar, resultados de calidad de muestra y costos. Aunque el rendimiento analítico tanto para VAMS como para DBS fue similar, los DBS fueron superiores en cuanto a criterios clínicos, calidad de muestreo y costos.

Abstract

Therapeutic drug monitoring (TDM) of immunosuppressants is essential to avoid either rejection or toxicity after solid organ transplantations. Capillary microsampling approaches are an outstanding alternative to conventional venous sampling for TDM (easy and non-invasive collection, enabling self-sampling, and cost-saving shipment, processing and storage). Volumetric absorptive microsampling (VAMS) has gained importance in the last years, as it was meant to overcome the hematocrit (Hct) related issues commonly associated to DBS analysis. Despite all the benefits, microsampling techniques performance (including a thorough clinical validation) should be set up before their implementation in clinical practice. The aim of this study was to perform a clinical validation for both tacrolimus (TAC) and mycophenolic acid (MPA) in both DBS and Mitra™ VAMS. For the clinical validations, two different requirements were set up: analytical (following EMA and FDA guidelines) and clinical (following the Royal College of Pathologists of Australasia -RCPA- recommendations) acceptance criteria. For DBS, both analytical and clinical acceptance criteria were fulfilled for TAC, with 98.7% and 95% of the paired samples within the preset limits, respectively. For MPA, the analytical criterion was met (70.6% of paired specimens), although only half of the pairs were within the clinical limits. For VAMS, the clinical validation for both TAC and MPA showed good correlations but significant lower concentrations in VAMS compared to the routine matrices. After VAMS concentrations correction, the analytical requirement was fulfilled for both analytes (71.1% for TAC, 75% for MPA), although the more restrictive criteria recommended by the RCPA were not met for any analyte (half of the samples fell within the acceptance area). In addition, no significant Hct impact on the quantification was found in any case. Also, a preliminary home-sampling trial was set up, showing promising results. Moreover, a comparison between VAMS vs. DBS analytical and clinical performances was carried out, including a home-sampling trial, sample quality results and costs. Although the analytical performance for both VAMS and DBS was similar, DBS were superior regarding clinical criteria, sampling quality and cost.

Link al artículo: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0731708521005549?via%3Dihub

Método en fluido oral

"A multidrug LC–MS/MS method for the determination of five immunosuppressants in oral fluid"

  • Desarrollo del primer método analítico LC-MS/MS para la determinación simultánea de los 5 fármacos inmunosupresores más relevantes y recetados que requieren de TDM en fluido oral.
  • Detección por primera vez de everolimus en fluido oral.
  • Primera comparación de diversos tipos de recolectores para la toma de muestras de fluido oral de pacientes en tratamiento con fármacos inmunosupresores. Demostración de la gran importancia de elegir el recolector de fluido oral más adecuado para garantizar la recuperación adecuada de los analitos en cuestión.

Objetivo: Este estudio tuvo como objetivo desarrollar y validar un método LC-MS/MS para el ácido micofenólico, tacrolimus, sirolimus, everolimus y ciclosporina A en el fluido oral (FO), como una herramienta esencial para estudiar la utilidad del FO como matriz alternativa para el monitoreo terapéutico de inmunosupresores; y encontrar el mejor recolector de FO para estos analitos. Materiales y Métodos: La separación cromatográfica se logró utilizando una columna analítica XBridge® Shield RP18 mantenida a 65ºC, utilizando formiato de amonio a 2 mM y ácido fórmico al 0,1% en agua (A) y acetonitrilo (B) como fase móvil. La muestra de FO se extrajo mediante extracción en fase sólida después de sonificación y precipitación de proteínas. Resultados y Conclusiones: La validación del método cumplió con todos los criterios de aceptación. Los Límites de Detección (LOD) fueron de 0,05-1 ng/ml, y los Límites de Cuantificación (LOQ) de 0,1-5 ng/ml. Los tubos silanizados ofrecieron las mejores recuperaciones. El método se aplicó con éxito a 31 muestras de FO, describiendo por primera vez la detección de everolimus en FO. Conclusión: El método propuesto es lo suficientemente sensible para la detección de concentraciones mínimas en el FO en pacientes que reciben inmunosupresores cuando se utiliza un recolector de FO adecuado.

Abstract

Aim: This study aimed: to develop and validate an LC-MS/MS method for mycophenolic acid, tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in oral fluid (OF), as an essential tool to study the usefulness of OF as an alternative matrix for immunossuppressants' therapeutic drug monitoring; and to find the best OF collector for these analytes. Materials & Methods: Chromatographic separation was achieved using an XBridge® Shield RP18 analytical column maintained at 65ºC, using 2 mM ammonium formate and 0.1% formic acid in water (A) and acetonitrile (B) as mobile phase. OF sample was extracted with solid phase extraction after sonication and protein precipitation. Results & Conclusions: Method validation met all the acceptance criteria. LODs were 0.05-1 ng/ml, and LOQs 0.1-5 ng/ml. Silanized tubes offered the best recoveries. The method was successfully applied to 31 OF specimens, describing everolimus detection in OF for the first time. Conclusion: The proposed method is sensitive enough for the detection of OF trough concentrations in patients receiving immunosuppressants when using an appropriate OF collector.

Link al artículo: https://www.future-science.com/doi/10.4155/bio-2019-0143?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org&rfr_dat=cr_pub++0pubmed

V.II. Tesis Doctoral

Nuevas estrategias en la monitorización terapéutica de fármacos inmunosupresores técnicas de microsampling de sangre seca y muestras de fluido oral

La presente Tesis Doctoral aborda el estudio de las técnicas de microsampling de sangre seca y las muestras de fluido oral como alternativas a las matrices tradicionales obtenidas por venopunción para la monitorización terapéutica de fármacos inmunosupresores. En concreto, dentro de las técnicas de microsampling se investigó la toma de muestras capilares mediante gotas de sangre seca o DBS y las micromuestras de absorción volumétrica o VAMS. Todas las metodologías desarrolladas fueron extensamente validadas, incluyendo los criterios específicos recomendados para las técnicas de microsampling. Además, se realizó una validación clínica comparando estadísticamente los resultados obtenidos en muestras de microsampling con respecto a los obtenidos en muestras tradicionales. Por otro lado, la aplicabilidad del fluido oral fue demostrada mediante la identificación y cuantificación de los fármacos inmunosupresores en muestras reales.

Tesis en acceso abierto en: https://minerva.usc.es/xmlui/handle/10347/27674

V.III. Congresos Internacionales

  • Oral fluid as an alternative matrix for therapeutic drug monitoring of immunosuppressants. The 57th Annual Meeting of the International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT). 2019, Birmingham, West Midlands, Reino Unido
  • Microsampling techniques for immunosuppressants’ TDM . 1 st Iberian Meeting in Separation< Sciences & Mass. SECyTA (Sociedad Española de Cromatografía y Técnicas Afines). 2019, Santiago de Compostela, España.
  • Volumetric Absorptive Microsampling (VAMS) as an alternative tool for tacrolimus and mycophenolic acid TDM. 18 th IATDMCT (International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology) International Congress. 2020, Ontario, Canadá.

VI. Contacto


Lucía Paniagua González, PhD
lucia.paniagua.gonzalez@usc.es
Tlf: +34 881 81 24 47
Servicio de Toxicología, Instituto de Ciencias Forenses "Luis Concheiro", C/San Francisco, s/n, 15782 Santiago de Compostela
Publons profile: 4870143
ORCID: 0000-0002-2278-717X
ScopusID: 57203395572
ResearcherID: ABG-7976-2021